Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine.

1. Pendahuluan
   Vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine adalah vaksin PRG inaktif diproduksi oleh Korea Biologicals Environmental products Pharmaceuticals, Inc (KBNP, Inc) yang akan diedarkan di Indonesia oleh PT Blue Sky Biotech. Vaksin ini ditujukan untuk pengendalian penyakit Newcastle Disease (ND), Infectious Bronchitis (IB) dan Egg Drop Syndrome (EDS) pada ternak ayam. Vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine mengandung jasad renik PRG berupa rekombinan virus ND strain La Sota (ATCC VR-699) dengan gen F dan HN dari virus ND strain KBNP 4152 (virus ND genotip VII). Virus ND La Sota telah sejak lama dipakai sebagai strain vaksin ND di Indonesia. Vaksin ini sudah terdaftar dan diedarkan (sudah mendapatkan Certificate of Free Sale) sebagai vaksin ND untuk unggas di negara Korea Selatan, Nepal, Myanmar dan Malaysia.Berdasarkan Peraturan Pemerintah No. 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik dan Peraturan Menteri Lingkungan Hidup No. 25 Tahun 2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko Lingkungan Produk Rekayasa Genetik, maka Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH PRG) telah melakukan pengkajian keamanan lingkungan vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine. Pengkajian didasarkan pada informasi genetik dan informasi keamanan lingkungan yang terdiri dari hospes alami dari tetua jasad renik PRG, sifat genetik yang direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG, kemampuan penyebaran jasad renik, dan kemungkinan menimbulkan risiko terhadap lingkungan sebagaimana diuraikan di bawah ini.
2. Informasi Jasad Renik PRG
   1. II.1.  Deskripsi Umum Jasad Renik PRGJasad renik PRG di dalam vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine ini adalah virus ND strain KBNP-C4152R2L, yang merupakan rekombinan antara virus ND strain La Sota (genotipe II) sebagai virus tetua dengan gen F dan HN dari virus ND strain KBNP-4152 (genotipe VII) sebagai donor gen. Virus ND strain La Sota merupakan virus yang tidak patogenik pada ayam. Virus ND strain La Sota secara umum tidak dapat menginfeksi ataupun menimbulkan penyakit pada manusia, hewan dan organisme non target lain (Cho et al. 2008).
   2. II.2.  Informasi Sifat Genetik Jasad Renik
      Tetua jasad renik yang direkayasa genetik ini adalah virus ND strain La Sota (ATCC VR- 699). Hospes alami dari virus ini adalah unggas.Gen F dan HN virus ND strain KBNP-4152 digunakan sebagai donor untuk menggantikan gen F dan HN dari virus tetuanya (virus ND strain La Sota). Jasad renik rekombinan ini disebut dengan virus ND strain KBNP-C4152R2L, yang telah terdaftar dalam GenBank dengan nomor akses EU140955. Virus ND rekombinan strain KBNP-C4152R2L telah diuji stabilitas genetiknya sampai dengan 10 kali pasase pada ayam Specific Pathogen Free

(SPF), 20 kali pasase pada embrio ayam, dan 10 kali pasase pada trakea ayam SPF (Cho et al. 2008).

II.3. Metoda Konstruksi Genetik

Metode konstruksi KBNP-C4152R2L adalah sebagai berikut:

1. Jasad renik PRG KBNP-C4152R2L adalah rekombinan antara virus ND strain La Sota (ATCC VR-699) dan gen HN dan F virus ND KBNP-4152.
2. Genom virus Newcastle disease strain La Sota dan strain KBNP-4152 diamplifikasi menggunakan RT-PCR sehingga diperoleh fragmen S1-S6 tanpa gen F dan HN dari virus ND strain La Sota dan fragmen S7-S8 yang mengandung gen F dan HN dari virus ND strain KBNP-4152.
3. Gen F pada fragmen S7-S8 dimutasi pada cleavage site dari 112RRQKRF117 (high pathogenic) menjadi 112GRQARL117 (low pathogenic). Fragmen S1-S6 dari virus ND strain La Sota serta fragmen S7-S8 dari virus ND strain KBNP-4152 yang telah dimutasi, dikonstruksi dengan bantuan plasmid vektor pTMH menjadi pTMH NDV. Secara singkat dapat diuraikan sebagai berikut: fragmen S7 yang merupakan bagian dari gen F virus KBNP-4152 yang telah dimutasi kemudian diligasi di antara fragment S6 dan S3 virus ND La Sota. Fragmen S8 yang merupakan bagian dari gen F dan HN virus KBNP-4152 yang telah dimutasi, selanjutnya diligasi di antara fragmen S7 virus KBNP-4152 dan S3 virus ND La Sota untuk menghasilkan urutan S1, S6, S7, S8, S3, S4, S2 yang menjadi pTMH NDV.
4. Plasmid yang mengekspresikan gen NP, P, L dari virus ND strain La Sota dikonstruksi menggunakan plasmid pcDNA3.1 Topo (Invitrogen) yang menghasilkan pcDNA-NP, pcDNA-P dan pcDNA-L.
5. Konstruksi plasmid pTMH NDV dikotransfeksikan bersama rekombinan vaccinia virus yang mengekspresikan T7 ke dalam kultur vero sel HEP-2. Hasil transfeksi kemudian diseleksi menjadi virus NDV rekombinan strain La Sota yang mengandung gen F dan HN yang telah dimodifikasi milik strain KBNP-4152 yang kemudian diberi nama strain KBNP-C4152R2L (Cho et al. 2008).

II.4. Karakter Modifikasi Genetik
Penyisipan gen F dan HN virus ND KBNP 4152 tidak mempengaruhi virulensi virus tetuanya, bahkan penggantian gen tersebut akan menyebabkan ekspresi protein yang berfungsi untuk memberikan perlindungan terhadap infeksi virus ND tipe VII yang saat ini banyak ditemukan di Indonesia (Adi et al. 2009; GenBank No. akses HQ 697254.1 sampai HQ 697261.1).

Virus ND rekombinan strain KBNP-C4152R2L bersifat stabil secara fenotipik, yang ditunjukkan dengan uji in vivo setelah pasase 10 kali intratrakea dan 20 kali pasase intracerebral pada anak ayam SPF. Hasil uji patogenisitas menunjukkan Mean Death Time (MDT) > 168 dan Intra Cerebral Pathogenic Index (ICPI) = 0 (Cho and Kim 2007). Dengan demikian maka strain dari virus ND hasil modifikasi yaitu strain KBNP-C4152R2L tetap sebagai virus strain lentogenik.

II.5. Kemungkinan terjadinya ketidakstabilan gen yang disisipkan sehingga dapat dipindahkan ke organisme lain

Jasad renik PRG di dalam vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine secara genotipe cukup stabil. Hal ini dibuktikan dengan kesamaan sekuens sampai dengan pasase ke-10 pada ayam SPF (tidak ditemukan mutasi pada cleavage site gen F). Data laboratorium juga menunjukkan stabilitas genetik virus PRG setelah pasase sebanyak 20 kali pada embrio ayam dan 10 kali pada trakea ayam SPF (Cho and Kim 2007).

Analisis BLAST menunjukkan gen F-HN tersebut tidak mempunyai homologi dengan sekuens gen organisme lain, sehingga perpindahan gen tidak dimungkinkan.

Galur virus ND strain KBNP-C4152R2L tidak akan berubah menjadi patogenik karena telah dilakukan double mutation melalui teknik side-directed mutagenesis.

Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik jasad renik PRG dalam vaksin ini dapat

disimpulkan bahwa :

1. Virus ND rekombinan strain KBNP-C4152R2L adalah rekombinan antara virus ND strainLa Sota dengan gen F dan HN dari virus ND strain KBNP-4152 yang telah dilakukan site-directed mutagenesis pada cleavage site. Penggantian gen F dan HN ini tidak mengubah sifat virulensi virus tetuanya.
2. Virus ND rekombinan strain KBNP-C4152R2L mengandung satu kopi gen F dan HN yang stabil secara genotipe dan fenotipe.
3. Gen F dan HN dari virus ND rekombinan strain KBNP-C4152R2L tidak berpeluang untuk disebarkan/dipindahkan ke organism lain.

III. Informasi Keamanan Lingkungan
III.1.Kemampuan Penyebaran Jasad Renik PRG dalam Vaksin

Virus ND rekombinan strain KBNP-C4152R2L di dalam Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine telah dimatikan (diinaktivasi) sehingga tidak dapat diisolasi kembali dari ekskreta hewan yang divaksinasi dan tidak ditemukan virus hidup di lingkungan.

III.2.Informasi Cakupan Hospes Organisme Tetua Virus PRG untuk Vaksin
Tetua virus ini adalah virus ND strain La Sota, termasuk dalam Famili Paramyxoviridae, Genus Avulavirus, Spesies Newcastle Disease Virus, strain La Sota (ATCC-VR-699). Hospes alaminya adalah ayam, sedangkan hospes alternatifnya adalah semua jenis unggas (Alexander and Senne 2003).

III.3.Informasi Kajian Molekuler
Sifat genetik yang direkayasa di dalam jasad renik PRG ini adalah penggantian gen F dan HN virus ND strain La Sota dengan gen F dan HN dari virus ND strain KBNP-4152. Gen F yang disisipkan sudah dilakukan side-directed mutagenesis dari 112RRQKRF117 menjadi 112GRQARL117. Perubahan ini dicirikan dengan data MDT dan ICPI. MDT pada strain KBNP-C4152R2L adalah >168 dan ICPI adalah 0. Berbeda dengan strain virus tetuanya yaitu strain La Sota dan strain virus donornya yaitu KBNP-4152 dengan nilai MDT masing- masing sebesar 114 dan 48, sedangkan nilai ICPI masing-masing sebesar 0,25 dan 1,92 (Cho et al. 2008). Dengan demikian maka virus ND strain KBNP-C4152R2L termasuk ke dalam strain lentogenik.

Penanda atau sekuen yang dapat dipakai untuk mengidentifikasi jasad renik PRG virus ND strain KBNP-C4152R2L adalah dengan menggunakan metode RT-PCR dengan primer NDPt-R (20mer) dengan susunan sekuen 5′-TGC CAC TGM TAG TTG YGA TA-3’ dan NDcomF156 (20mer) dengan susunan sekuen 5′-ATA CAC CTC RTC YCA GAC AG-3’ , serta dikonfirmasi dengan menggunakan metoda sekuensing (Cho and Kim 2013).

III.4.Kemungkinan Dampak Negatif Jasad Renik PRG dalam Vaksin terhadap Lingkungan Analisis BLAST menunjukkan gen F dan HN tersebut tidak mempunyai homologi dengan

sekuens gen organisme lain, sehingga tidak memungkinkan terjadinya perpindahan gen.

Virus ND strain KBNP-C4152R2L memiliki nilai MDT >168 dan ICPI 0. Dengan demikian virus ND strain KBNP-C4152R2L termasuk ke dalam strain lentogenik.

Jasad renik PRG di dalam vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine merupakan virus yang telah dimatikan sehingga tidak berpotensi menyebar ke lingkungan maupun organisme non target. Oleh karena itu, jasad renik PRG di dalam Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine sehingga tidak ada kemungkinan risiko terhadap lingkungan.

IV.Informasi Produk
Sebelum mendapatkan sertifikat keamanan lingkungan produk ini telah diinformasikan kepada pemangku kepentingan melalui komunikasi risiko. Setelah mendapatkan izin peredaran, informasi dan komunikasi mengenai produk dapat dilakukan melalui :

1. Website : www.kbnp.net atau www.kbnp.co.kr
2. E-mail : kbnpexport@kbnp.co.kr atau sales.bsbiotech@gmail.com
3. Media massa majalah INFOVET dan POULTRY
4. Pertemuan berkala yang dilakukan Technical Sales Representative (TSR) denganpengguna

KESIMPULAN
Atas dasar hasil pengkajian tentang informasi jasad renik PRG, keamanan lingkungan, komunikasi risiko lingkungan, serta rencana pengelolaan dan pemantauan Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine disimpulkan hal-hal berikut :

1. Vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine bersifat aman terhadap lingkungan karena tidak berisiko menyebarkan jasad renik ke lingkungan. Hal ini karena jasad renik PRG di dalam vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine merupakan virus yang telah dimatikan sehingga tidak menyebar ke lingkungan.
2. Berdasarkan kajian stabilitas genotipe dan fenotipe jasad renik PRG dalam vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine dinyatakan stabil.
3. TTKH PRG Bidang Keamanan Lingkungan menilai bahwa vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine yang diajukan adalah aman terhadap lingkungan.
4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan lingkungan yang diperoleh hingga saat ini, maka status aman lingkungan terhadap vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine perlu dikaji ulang.
5. Apabila setelah ditetapkan aman lingkungan, kemudian produk tersebut terbukti menimbulkan risiko terhadap kesehatan manusia dan hewan maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan serta memusnahkan vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine yang berada di wilayah teritori Indonesia.
6. Vaksin Himmvac Dalguban BEN plus Oil Vaccine tidak boleh digunakan sebagai vaksin ayam sebelum memperoleh ijin aman lingkungan.

PUSTAKA

1. Adi AAAM, Astawa NM, Putra KSA, Hayashi Y, Matsumoto Y. (2010) Isolation and characterization of a pathogenic Newcastle disease from a natural case in Indonesia. J. Vet. Med. Sci. 72(3): 313-319.
2. Alexander DJ, Senne DA. 2003. Newcastle disease, other avian paramyxoviruses, and pneumovirus infections. In: Saif YM (ed) Disease of Poultry, 7th ed. Iowa State University Press. Ames, p 63-92
3. Cho SH, Kim CH. (2007) Genetic Stability of KBNP-C4152R2L Strain. BioPOA.
4. Cho SH, Kwon HJ, Kim TE, Kim JH, Yoo HS, Park MH, Park YH, dan Kim SJ. (2008) Characterization of a recombinant Newcastle disease virus vaccine strain. Clin. Vacc.Imunol. 15(10): 1572-1579.
5. Cho SH, Kim CH. (2013) Primer Sequence for Identification KBNP-C4152R2L Strain.BioPOA.
6. Hasil BLAST jasad renik PRG. (2014) www. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi [14 Februari 2014].